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    光學顯微鏡基本知識
    1. [ 日期:2018-11-14 查看次數:1106 ]

    一、 顯微鏡的基本光學原理
    (一) 折射和折射率
    光線在均勻的各向同性介質中,兩點之間以直線傳播,當通過不同密度介質的透明物體時,則發生折射現象,這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。當與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時,光線在其介面改變了方向,并和法線構成折射角。
    (二) 透鏡的性能
    透鏡是組成顯微鏡光學系統的最基本的光學元件,物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同,可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。 
    當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點,這個點稱"焦點",通過交點并垂直光軸的平面,稱"焦平面"。焦點有兩個,在物方空間的焦點,稱"物方焦點",該處的焦平面,稱"物方焦平面";反之,在象方空間的焦點,稱"象方焦點",該處的焦平面,稱"象方焦平面"。 
    光線通過凹透鏡后,成正立虛像,而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現出來,而虛像不能。
    (三) 凸透鏡的五種成象規律
    1. 當物**于透鏡物方二倍焦距以外時,則在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象; 
    2. 當物**于透鏡物方二倍焦距上時,則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象;
    3. 當物**于透鏡物方二倍焦距以內,焦點以外時,則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象;

    4. 當物**于透鏡物方焦點上時,則象方不能成象;
    5. 當物**于透鏡物方焦點以內時,則象方也無象的形成,而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。
    二、 光學顯微鏡的成象(幾何成象)原理
    只有當物體對人眼的張角不小于某一值時,肉眼才能區別其各個細部,該量稱為目視分辨率ε。在最佳條件下,即物體的照度為50~70lx及其對比度較大時,可達到1'。為易于觀測,一般將該量加大到2',并取此為平均目鏡分辨率。
    物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關。有公式y=Lε
    距離L不能取得很小,因為眼睛的調節能力有一定限度,尤其是眼睛在接近調節能力的極限范圍工作時,會使視力極度疲勞。對于標準(正視)而言,最佳的視距規定為250mm(明視距離)。這意味著,在沒有儀器的條件下,目視分辨率ε=2'的眼睛,能清楚地區分大小為0.15mm的物體細節。
    在觀測視角小于1'的物體時,必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應予放大的物體的。


    (一) 放大鏡的成像原理
    表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡可以使物體放大成像,光路圖如圖1所示。位于物方焦點F以內的物AB,其大小為y,它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。
    放大鏡的放大率
    Γ=250/f'
    式中250--明視距離,單位為mm
    f'--放大鏡焦距,單位為mm
    該放大率是指在250mm的距離內用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。

    (二) 顯微鏡的成像原理
    顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用,就是把近處的微小物體成一放大的像,以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。
    圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計,把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方,離開物鏡的距離大于物鏡的焦距,但小于兩倍物鏡焦距。所以,它經物鏡以后,必然形成一個倒立的放大的實像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點F2上,或者在很靠近F2的位置上。再經目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。虛像A''B''的位置取決于F2和A'B'之間的距離,可以在無限遠處(當A'B'位于F2上時),也可以在觀察者的明視距離處(當A'B'在圖中焦點F2之右邊時)。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身,而是物體被物鏡所成的已經放大了一次的像。 

    (三) 顯微鏡的重要光學技術參數
    在鏡檢時,人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象,這就需要顯微鏡的各項光學技術參數達到一定的標準,并且要求在使用時,必須根據鏡檢的目的和實際情況來協調各參數的關系。只有這樣,才能充分發揮顯微鏡應有的性能,得到滿意的鏡檢效果。
    顯微鏡的光學技術參數包括:數值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數并不都是越高越好,它們之間是相互聯系又相互制約的,在使用時,應根據鏡檢的目的和實際情況來協調參數間的關系,但應以保證分辨率為準。

    1. 數值孔徑
    數值孔徑簡寫NA,數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數,是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低的重要標志。其數值的大小,分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。
    數值孔徑(NA)是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率(n)和孔徑角(u)半數的正弦之乘積。用公式表示如下:NA=nsinu/2
    孔徑角又稱"鏡口角",是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度??讖浇窃酱?,進入物鏡的光通亮就越大,它與物鏡的有效直徑成正比,與焦點的距離成反比。
    顯微鏡觀察時,若想增大NA值,孔徑角是無法增大的,唯一的辦法是增大介質的折射率n值?;谶@一原理,就產生了水浸物鏡和油浸物鏡,因介質的折射率n值大于1,NA值就能大于1。
    數值孔徑最大值為1.4,這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前,有用折射率高的溴萘作介質,溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。
    這里必須指出,為了充分發揮物鏡數值孔徑的作用,在觀察時,聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。
    數值孔徑與其他技術參數有著密切的關系,它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比,與放大率成正比,與焦深成反比,NA值增大,視場寬度與工作距離都會相應地變小。

    2. 分辨率
    顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距,又稱"鑒別率"。其計算公式是σ=λ/NA
    式中σ為最小分辨距離;λ為光線的波長;NA為物鏡的數值孔徑??梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大,照明光線波長越短,則σ值越小,分辨率就越高。
    要提高分辨率,即減小σ值,可采取以下措施
    (1) 降低波長λ值,使用短波長光源。
    (2) 增大介質n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。
    (3) 增大孔徑角u值以提高NA值。
    (4) 增加明暗反差。

    3. 放大率和有效放大率
    由于經過物鏡和目鏡的兩次放大,所以顯微鏡總的放大率Γ應該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積:
    Γ=βΓ1
    顯然,和放大鏡相比,顯微鏡可以具有高得多的放大率,并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡,能夠方便地改變顯微鏡的放大率。
    放大率也是顯微鏡的重要參數,但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。
    分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯系的概念。有關系式:500NA<Γ<1000NA
    當選用的物鏡數值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結構,此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是一個輪廓雖大但細節不清的圖像,稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發揮顯微鏡的分辨能力,應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。 
    4. 焦深
    焦深為焦點深度的簡稱,即在使用顯微鏡時,當焦點對準某一物體時,不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度內,也能看得清楚,這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層,而焦深小,則只能看到被檢物體的一薄層,焦深與其他技術參數有以下關系:
    (1) 焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔徑成反比。
    (2) 焦深大,分辨率降低。 
    由于低倍物鏡的景深較大,所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。

    5. 視場直徑(Field Of View)
    觀察顯微鏡時,所看到的明亮的圓形范圍叫視場,它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。
    視場直徑也稱視場寬度,是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大,愈便于觀察。
    有公式 F=FN/β
    式中F: 視場直徑,FN:視場數(Field Number, 簡寫為FN,標刻在目鏡的鏡筒外側),β:物鏡放大率。
    由公式可看出:
    (1) 視場直徑與視場數成正比。
    (2) 增大物鏡的倍數,則視場直徑減小。因此,若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌,而換成高倍物鏡,就只能看到被檢物體的很小一部份。 

    6. 覆蓋差
    顯微鏡的光學系統也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準,光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發生了改變,從而產生了相差,這就是覆蓋差。覆蓋差的產生影響了顯微鏡的成響質量。
    國際上規定,蓋玻片的標準厚度為0.17mm,許可范圍在0.16-0.18mm,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17,即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。

    7. 工作距離WD
    工作距離也叫物距,即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時,被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此,它與焦距是兩個概念,平時習慣所說的調焦,實際上是調節工作距離。 
    在物鏡數值孔徑一定的情況下,工作距離短孔徑角則大。
    數值孔徑大的高倍物鏡,其工作距離小。

    (四) 物鏡
    物鏡是顯微鏡最重要的光學部件,利用光線使被檢物體第一次成象,因而直接關系和影響成象的質量和各項光學技術參數,是衡量一臺顯微鏡質量的首要標準。
    物鏡的結構復雜,制作精密,由于對象差的校正,金屬的物鏡筒內由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求,如合軸,齊焦。
    齊焦既是在鏡檢時,當用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后,在轉換另一倍率的物鏡時,其成象亦應基本清晰,而且象的中心偏離也應該在一定的范圍內,也就是合軸程度。齊焦性能的優劣和合軸程度的高低是顯微鏡  質量的一個重要標志,它是與物鏡的本身質量和物鏡轉換器的精度有關。 
    現代顯微物鏡已達到高度完善,其數值孔徑已接近極限,視場中心的分辨率與理論值之區別已微乎其微。但繼續增大顯微物鏡視場與提高視場邊緣成象質量的可能性仍然存在,這種研究工作,至今仍在進行。
    顯微物鏡與目鏡在參于成象這點上是有區別的。物鏡是顯微鏡最復雜和最重要的部分,在寬光束中工作(孔徑大),但這些光束與光軸的傾角較小(視場小);目鏡在窄光束中工作,但其傾角大(視場大)。當計算物鏡與目鏡,在消除象差上有很大差別。
    與寬光束有關的象差是球差、慧差以及位置色差;與視場有關的象差是象散、場曲、畸變以及倍率包差。
    顯微物鏡是一消球差系統。這意味著:就軸上的一對共軛點而言,消除了球差并且實現了正弦條件時,每一物鏡僅有兩個這種消球差點。因此,物體與象的計算位置的任何改變均導致象差變大。
    1. 物鏡的主要參數
    (1) 放大率β
    (2) 數值孔徑NA
    (3) 機械筒長L:在顯微鏡中,物鏡支承面到目鏡支承面之間的距離稱為機械筒長。對于一臺顯微鏡來說,機械筒長是固定的。我國規定機械筒長是160毫米。
    (4) 蓋玻片厚度d
    (5) 工作距離WD
    這些參數,大多刻在物鏡筒上,如圖3所示。
    有一種所謂筒長無限的顯微物鏡,這種物鏡的后方一般帶有輔助物鏡(也叫補償物鏡或鏡筒物鏡),被觀察物體位于物鏡前焦點上,經過物鏡以后,成像在無限遠,再經過輔助物鏡成像在輔助物鏡的焦平面上,如圖4所示。在物鏡和輔助物鏡之間是平行光,所以中間距離比較自由一些,可以加入棱鏡等光學元件。

    2. 物鏡的基本類型
    (1) 按顯微鏡鏡筒長度(以mm計):透射光用160鏡筒,帶0.17mm厚或更厚的蓋玻片;反射光用190鏡筒,不帶蓋玻片;透射光與反射光用鏡筒,筒長無限大。
    (2) 按浸法特征:非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。
    (3) 按光學裝置:透射式、反射式以及折反射式。
    (4) 按數值孔徑和放大倍數:低倍(NA≤0.2與β≤10X),中倍(NA≤0.65與β≤40X),高倍(NA>0.65與β>40X)。
    (5) 按校正象差的情況不同,通常分為消色差物鏡,半復消色差物鏡,復消色差物鏡,平視場消色差物鏡,平視場復消色差物鏡和單色物鏡。
    a. 消色差物鏡(Achromatic objective)
    這是應用最廣泛的一類顯微物鏡,外殼上常有"Ach"字樣。它校正了軸上點的位置色差(紅,藍二色)、球差(黃綠光)和正弦差,保持了齊明條件。軸外點的象散不超過允許值(-4屬光度),二級光譜未校正。
    數值孔徑為0.1~0.15的低倍消色差物鏡一般由兩片透鏡膠合在一起的雙膠物鏡構成。數值孔徑至0.2的消色差物鏡由兩組雙膠透鏡構成。當數值孔徑增大到0.3時,再加入一平凸透鏡,該平凸透鏡決定著物鏡的焦距,而其它透鏡則補償由其平面與球面產生的象差。高倍物鏡的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物鏡一般均為浸式,由四部分構成:前片透鏡、新月形透鏡及兩個雙膠透鏡組。
    b. 復消色差物鏡(Apochromatic objective)
    這類物鏡的結構復雜,透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成,物鏡的外殼上標有"Apo"字樣。它對兩個色光實現了正弦條件,要求嚴格地校正軸上點的位置色差(紅,藍二色)、球差(紅,藍二色)和正弦差,同時要求校正二級光譜(再校正綠光的位置色差)。其倍率色差并不能完全校正,一般須用目鏡補償。
    由于對各種象差的校正極為完善,比響應倍率的消色差物鏡有更大的數值孔徑,這樣不僅分辨率高,象質量優而且也有更高的有效放大率。因此,復消色差物鏡的性能很高,適用于高級研究鏡檢和顯微照相。
    c. 半復消色差物鏡(Semi apochromatic objective)
    半復消色差物鏡又稱氟石物鏡,物鏡的外殼上標有"FL"字樣。在結構上透鏡的數目比消色差物鏡多,比復消色差物鏡少,成象質量上,遠較消色差物鏡為好,接近于復消色差物鏡。
    d. 平視場物鏡(Plan objective )
    平場物鏡是在物鏡的透鏡系統中增加一快半月形的厚透鏡,以達到校正場曲的缺陷,提高視場邊緣成像質量的目的。平場物鏡的視場平坦,更適用于鏡檢和顯微照相。對于平視場消色差物鏡,其倍率色差不大,不必用特殊目鏡補償。而平視場復消色差物鏡,則必須用目鏡來補償它的倍率色差。
    e. 單色物鏡
    這類物鏡由石英、熒石或氟化鋰制的一組單片透鏡構成。只能在紫外線光譜區的個別區內使用(寬度不超過20mm),可見光譜區不能采用單色物鏡。這類物鏡均制成反射式與折反射式系統。主要缺點是相當大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面積的25%)。在新型折反射系統中,由于采用半透明反射鏡以及物鏡的膠合結構,使這一缺點大為減輕,從而可以取消反射鏡框的遮光。并且兩同軸反射鏡的殘余象差是互相補償的,同時用透鏡組來增大數值孔徑。若系統的校正滿意,孔徑達到NA=1.4時,中心遮蔽可不超過入瞳面積的4%。
    f. 特種物鏡
    所謂"特種物鏡"是在上述物鏡的基礎上,專門為達到某些特定的觀察效果而設計制造的。主要有以下幾種: 
    (a) 帶校正環物鏡(Correction collar objective)
    在物鏡的中部裝有環裝的調節環,當轉動調節環時,可調節物鏡內透鏡組之間的距離,從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋差。調節環上的刻度可從0 .11--.023,在物鏡的外殼上也標科有此數字,表明可校正蓋玻片從0.11-0.23mm厚度之間的誤差。
    (b) 帶虹彩光闌的物鏡(Iris diaphragm objective)
    在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌,外方也可以旋轉的調節環,轉動時可調節光闌孔徑的大小,這種結構的物鏡是高級的油浸物鏡,它的作用是在暗視場鏡檢時,往往由于某些原因而使照明光線進入物鏡,使視場背景不夠黑暗,造成鏡檢質量的下降。這時調節光闌的大小,使背景變黑,使被檢物體更明亮,增強鏡檢效果。 
    (c) 相襯物鏡(Phase contrast objective)
    這種物鏡是由于相襯鏡檢術的專用物鏡,其特點是在物鏡的后焦平面處裝有相板。
    (d) 無罩物鏡(No cover objective)
    有些被檢物體,如涂抹制片等,上面不能加用蓋玻片,這樣在鏡檢時應使用無罩物鏡,否則圖象質量將明顯下降,特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC,同時在蓋玻片厚度的位置上沒有0.17的字樣,而標刻著"0"。
    (e) 長工作距離物鏡
    這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡,它是為了滿足組織培養,懸浮液等材料的鏡檢而設計。

    (五) 目鏡
    目鏡的作用是把物鏡放大的實象(中間象)再放大一級,并把物象映入觀察者的眼中,實質上目鏡就是一個放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數值孔徑所決定的,而目鏡只是起放大作用。因此,對于物鏡不能分辨出的結構,目鏡放的再大,也仍然不能分辨出。

    (六) 聚光鏡
    聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡,在使用數值孔徑0.40以上的物鏡時,則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質,而且將光線聚焦于被檢物體上,以得到最好的照明效果。 
    聚光鏡的的結構有多種,同時根據物鏡數值孔徑的大小,相應地對聚光鏡的要求也不同 。
    1. 阿貝聚光鏡(Abbe condenser)
    這是由德國光學大學大師恩斯特.阿貝(Ernst Abbe)設計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成,有較好的聚光能力,但是在物鏡數值孔徑高于0.60時,則色差,球差就顯示出來。因此,多用于普通顯微鏡上。
    2. 消色差聚光鏡(Achromatic aplanatic condenser )
    這種聚光鏡又名"消球差聚光鏡"和"齊明聚光鏡",它由一系列透鏡組成,它對色差球差的校正程度很高,能得到理想的圖象,是明場鏡檢中質量最高的一種聚光鏡,其NA值達1.4 。因此,在高級研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4 X以下的低倍物鏡,否則照明光源不能充滿整個視場。
    3. 搖出式聚光鏡(Swing out condenser)
    在使用低倍物鏡時(如4X),由于視場大,光源所形成的光錐不能充滿真整個視場,造成視場邊緣部分黑暗,只中央部分被照亮。要使視場充滿照明,就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。
    4. 其它聚光鏡
    聚光鏡除上述明場使用的類型外,還有作特殊用圖的聚光鏡。如暗視場聚光鏡,相襯聚光鏡,偏光聚光鏡,微分干涉聚光鏡等,以上聚光鏡分別適用于相應的觀察方式。
    (七) 照明方法
    顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成,可分為"透射式照明",和"落射式照明"兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體,絕大數生物顯微鏡屬于此類照明法;后者則適用于非透明的被檢物體,光源來自上方,又稱""反射式照明"。主要應用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。
    1. 透射式照明
    生物顯微鏡多用來觀察透明標本,需要以透射光來照明。有兩種照明方式
    (1) 臨界照明(Critical illumination) 光源經過聚光鏡后,成像于物平面上,如圖5所示。若忽略光能的損失,則光源像的亮度與光源本身相同,因此,這種方法相當于在物平面上放置光源。顯然,在臨界照明中,如果光源表面亮度不均勻,或明顯地表現出細小的結構,如燈絲等,那么就要嚴重影響顯微鏡觀察效果,這是臨界照明的缺點。其補救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片,使照明變得較為均勻和避免光源的長時間的照射而損傷被檢物體。用透射光照明時,物鏡成像光束的孔徑角,被聚光鏡像方光束的孔徑角所決定,為使物鏡的數值孔徑得到充分利用,聚光鏡應有與物鏡相同或稍大的數值孔徑。 
    (2) 柯拉照明 臨界照明中物面光照度不均勻的缺點,在柯拉照明中可以消除。在光源1與聚光鏡5之間加一輔助聚光鏡2,如圖6所示??梢?,由于不是直接把光源,而是把被光源均勻照明了的輔助聚光鏡2(也稱為柯拉鏡)成像在標本6上,所以物鏡的視場(標本)得到均勻的照明。
    2. 落射式照明
    在觀察不透明物體時,例如通過金相顯微鏡觀察金屬磨片,往往是采用從側面或者從上面加以照明的方式。此時,被觀察物體的表面上沒有蓋玻璃片,標本像的產生是靠進入物鏡的反射或散射光線。如圖7所示。
    3. 用暗視場來觀察微粒的照明方法
    用暗視場方法可以觀察超顯微質點。所謂超顯微質點,是指那些小于顯微鏡分辨極限的微小質點。暗視場照明的原理是:不使主要的照明光線進入物鏡,能夠進入物鏡成像的只是由微粒所散射的光線。

    因此,在暗的背景上給出了亮的微粒的像,視場背景雖暗,但襯度(對比)很好,可以使分辨率提高。 
    暗視場照明又有單向和雙向之分
    (1) 單向暗視場照明 圖8是單向暗視場照明示意圖。由圖可見,由照明器2發出的光線,經不透明的標本片1反射后,主要的光線都沒有進入物鏡3,進入物鏡的光線主要是由微?;蛲拱疾黄降募毑克⑸涞墓饩€。顯然,這種單向的暗視場照明,對觀察微粒的存在和運動是有效的,但對物體細節的再現不是有效的,即存在"失真"的現象。
    (2) 雙向暗視場照明 雙向暗視場照明,可以消除單向所產生的失真缺點。在普通的三透鏡聚光鏡前面,安置一個環形光闌,如圖9即可實現雙向暗視場照明。在聚光鏡的最后一片與載物玻璃片之間浸以液體,而蓋玻璃片與物鏡之間是干的。于是,經過聚光鏡的環形光束,在蓋玻璃片內全反射而不能進入物鏡,形成如圖中的回路。進入物鏡的只是由標本上的微粒所散射的光線,形成了雙向暗視場照明。


    三、 光學顯微鏡的組成結構
    光學顯微鏡包括光學系統和機械裝置兩大部分,而數碼顯微鏡還包括數碼攝像系統,現分述如下:
    (一) 機械裝置
    1. 機架 顯微鏡的主體部分,包括底座和彎臂。
    2. 目鏡筒 位于機架上方,靠圓形燕尾槽與機架固定,目鏡插在其上。根據有否攝像功能,可分為雙目鏡筒和三目鏡筒;根據瞳距的調節方式不同,可分為鉸鏈式和平移式。
    3. 物鏡轉換器 它是一個旋轉圓盤,上有3~5個孔,分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉動物鏡轉換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。
    4. 載物臺 是放置玻片的平臺,其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾,用來夾住載玻片。右下方有移動手柄,使載物臺面可在XY雙方向進行移動。
    5. 調焦機構 利用調焦手輪可以驅動調焦機構,使載物臺作粗調和微調的升降運動,從而使被觀察物體對焦清晰成像。
    6. 聚光器調節機構 聚光器安裝在其上,調節螺旋可以使聚光器升降,用以調節光線的強弱。
    (二) 光學系統
    1. 目鏡 它是插在目鏡筒頂部的鏡頭,由一組透鏡組成,可以使物鏡成倍地分辨、放大物像,例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小,目鏡可分為視場較小的普通目鏡,和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。較高檔顯微鏡的目鏡上還裝有視度調節機構,操作者可以方便快捷地對左右眼分別進行視度調整;此外,在這些目鏡上可以加裝測量分劃板,測量分劃板的象總能清晰地調焦在標本的焦面上;并且,為了防止目鏡被取走以及減少運輸中被損壞的可能性,這些目鏡可以被鎖定。 
    2. 物鏡 它安裝在轉換器的孔上,也是由一組透鏡組成的,能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數,主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡,即在物鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體(如杉木油),它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
    3. 光源 有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。
    4. 聚光器 包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成,它可以集中透射過來的光線,使更多的光能集中到被觀察的部位??讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍,用以調節光的強度。
    (三) 數碼攝像系統 
    1. 攝像頭
    2. 圖像采集卡
    3. 軟件
    4. 微機

    四、 光學顯微鏡的分類
    光學顯微鏡有多種分類方法:按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡;按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡;按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等;按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等;按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等;按接收器類型可分為目視、數碼(攝像)顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。
    1. 雙目體視顯微鏡
    雙目體視顯微鏡又稱"實體顯微鏡"或"解剖鏡",是一種具有正象立體感地目視儀器。在生物、醫學領域廣泛用于切片操作和顯微外科手術;在工業中用于微小零件和集成電路的觀測、裝配、檢查等工作。它具有如下特點:
    (1) 利用雙通道光路,雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行,而是具有一定的夾角--體視角(一般為12度--15度),為左右兩眼提供一個具有立體感的圖像。它實質上是兩個單鏡筒顯微鏡并列放置,兩個鏡筒的光軸構成相當于人們用雙目觀察一個物體時所形成的視角,以此形成三維空間的立體視覺圖像。
    (2) 象是直立的,便于操作和解剖,這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉過來的緣故。 
    (3) 雖然放大率不如常規顯微鏡,但其工作距離很長。
    (4) 焦深大,便于觀察被檢物體的全層。
    (5) 視場直徑大。
    目前體視鏡的光學結構是:由一個共用的初級物鏡,對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開,并成一體視角再經各自的目鏡成象,它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的,因此又稱為"連續變倍體視顯微鏡"(Zoom-stereo microscope)。隨著應用的要求,目前體視鏡可選配豐富的選購附件,如熒光,照相,攝象,冷光源等等。
    2. 金相顯微鏡
    金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察,故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光,而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面,被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測工作。 
    3. 偏光顯微鏡(Polarizing microscope)
    偏光顯微鏡是用于研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色法來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡。
    (1) 偏光顯微鏡的特點
    將普通光改變為偏振光進行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。雙折射性是晶體的基本特性。因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物、化學等領域,在生物學和植物學也有應用。 
    (2) 偏光顯微鏡的基本原理
    偏光顯微鏡的原理比較復雜,在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件:起偏鏡,檢偏鏡,補償器或相位片,專用無應力物鏡,旋轉載物臺。
    (3) 偏光鏡檢術的方式
    正相鏡檢(Orthscope):又稱無畸變鏡檢,其特點是使用低倍物鏡,不用伯特蘭透鏡(Bertrand Lens), 被研究對象可直接用偏振光研究。同時為使照明孔徑變小,推開聚光鏡的上透鏡。正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。 
    b. 錐光鏡檢(Conoscope):又稱干涉鏡檢,研究在偏振光干涉時產生的干涉圖樣,這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。在該方法中,用強會聚偏振光束照明。
    (4) 偏光顯微鏡在裝置上的要求
    a. 光源:最好采用單色光,因為光的速度,折射率,和干涉現象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。
    b. 目鏡:要帶有十字線的目鏡。
    c. 聚光鏡:為了取得平行偏光,應使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。
    d. 伯特蘭透鏡:聚光鏡光路中的輔助部件,這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。它可保證用目鏡來觀察在物鏡后焦平面中形成的平涉圖樣。 
    (5) 偏光鏡檢術的要求
    a. 載物臺的中心與光軸同軸。
    b. 起偏鏡和檢偏鏡應處于正交位置。
    c. 制片不宜過薄。
    4. 熒光顯微鏡
    熒光顯微鏡是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發后而產生長波長的熒光,然后觀察。熒光顯微鏡廣泛應用于生物,醫學等領域。 
    (1) 熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。
    a. 透射式:激發光來自被檢物體的下方,聚光鏡為暗視野聚光鏡,使激發光不進入物鏡,而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮,而高倍則暗,在油浸和調中時,較難操作,尤以低倍的照明范圍難于確定,但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。 
    b. 落射式:透射式目前幾乎被淘汰,新型的熒光顯微鏡多為落射式,光源來自被檢物體的上方,在光路中具有分光鏡,所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用,不僅便于操作,而且從低倍到高倍,可以實現整個視場的均勻照明。
    (2) 熒光鏡檢術的注意事項
    a. 激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象,因此盡可能縮短觀察時間,暫時不觀察時,應用擋板遮蓋激發光。
    b. 作油鏡觀察時,應用"無熒光油"。
    c. 熒光幾乎都較弱,應在較暗的室內進行。
    d. 電源最好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。
    目前許多新興生物研究領域應用到熒光顯微鏡,如基因原位雜交(FISH)等等。
    5. 相襯顯微鏡(Phase contrast microscope)
    在光學顯微鏡的發展過程中,相襯鏡檢術的發明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道,人眼只能區分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本。
    相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現象,將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察,因此相襯鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡中。 
    相襯鏡檢法在裝置上與明場不同,有一些特殊要求:
    a. 環狀光闌(Ring slit): 裝在聚光鏡的下方,而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大a. 小不同的環形光闌裝在一圓盤內,外面標有10X、20X、40X、100X等字樣,與相對應倍數的物鏡配合使用。
    b. 相板(Phase plate): 裝在物鏡的后焦平面處,它分為兩部分,一是通過直射光的部分,為半透明的環狀,叫共軛面;另一是通過衍射光的部分,?quot;補償面"。有相板的物鏡稱"相襯物鏡",外殼上常有"Ph"字樣。
    相襯鏡檢法是一種比較復雜的鏡檢方法,想要得到好的觀察效果,顯微鏡的調試非常重要。除此之外還應注意以下幾個方面:
    a. 光源要強,全部開啟孔徑光闌;
    b. 使用濾色片,使光波近于單色。
    6. 微分干涉對比顯微鏡(Differential interference contrast DIC)
    微分干涉對比鏡檢術出現于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點,觀察效果更為逼真。
    (1) 原理
    微分干涉對比鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小,而不出現重影現象,使圖象呈現出立體的三維感覺。 
    (2) 微分干涉對比鏡檢術所需的特殊部件:
    a. 起偏鏡
    b. 檢偏鏡
    c. 渥拉斯頓棱鏡2 塊
    (3) 微分干涉對比鏡檢時的注意事項
    a. 因微分干涉靈敏度高,制片表面不能有污物和灰塵。
    b. 具有雙折射性的物質,不能達到微分干涉對比鏡檢的效果。
    c. 倒置顯微鏡應用微分干涉時,不能用塑料培養皿。
    7. 倒置顯微鏡(Inverted microscope)
    倒置顯微鏡是為了適應生物學、醫學等領域中的組織培養、細胞離體培養、浮游生物、環境保護、食品檢驗等顯微觀察。
    由于上述樣品特點的限制,被檢物體均放置在培養皿(或培養瓶)中,這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長,能直接對培養皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此,物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來,故稱為"倒置顯微鏡"。
    由于工作距離的限制,倒置顯微鏡物鏡的最大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物鏡,因為倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要,也可以選配其它附件,用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。 
    目見倒置顯微鏡廣泛應用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領域。
    8. 數碼顯微鏡
    數碼顯微鏡是以攝像頭(即電視攝像靶或電荷耦合器)作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實像面處裝入攝像頭取代人眼作為接收器,通過這種光電器件把光學圖像轉換成電信號的圖像,然后對之進行尺寸檢測、顆粒計數等工作。這類顯微鏡可以與計算機聯用,這便于實現檢測和信息處理的自動化,多應用于需要進行大量繁瑣檢測工作的場合。


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